在tRNA二级结构基础上，通过氨基酸接受茎与C茎以及D茎与反密码茎间折叠成右手反平行双螺旋形成三级结构。

tRNA三级结构由保守或半保守成分与构成二级结构的核苷酸之间形成氢键(称三级结构氢键)维系。形成三级结构的很多氢键与tRNA中不变的核苷酸密切有关，这就使得各种tRNA三级结构都呈倒L形的。

tRNA一般指转运RNA，又称传送核糖核酸、转移核糖核酸，通常简称为tRNA，是一种由76-90个核苷酸所组成的RNA，其3'端可以在氨酰-tRNA合成酶催化之下，接附特定种类的氨基酸。

转译的过程中，tRNA可借由自身的反密码子识别mRNA上的密码子，将该密码子对应的氨基酸转运至核糖体合成中的多肽链上。每个tRNA分子理论上只能与一种氨基酸接附，但是遗传密码有简并性，使得有多于一个以上的tRNA可以跟一种氨基酸接附。